A feasible method to extract DNA from the cambium of high-canopy trees: from harvest to assessment

Muitas árvores tropicais possuem dossel alto e folhas não facilmente acessíveis. O uso de tecido de um órgão mais acessível (câmbio) para extração de DNA pode ser uma alternativa para estudos moleculares. Nós adaptamos uma metodologia viável para extrair DNA genômico de tecido cambial coletado no campo para avaliação com PCR. Testamos três condições de armazenamento (dois tampões e sílica gel) e quatro períodos após a coleta. Utilizamos protocolos descritos anteriormente e os testamos em três espécies encontradas em florestas amazônicas e outros biomas: Anadenanthera peregrina var. peregrina, Cedrela fissilis e Ceiba speciosa. Nosso protocolo foi eficaz na obtenção de DNA adequado para sequenciamento e genotipagem de microssatélites. Recomendamos o uso de sílica para armazenamento de longo prazo e o tampão com ácido ascórbico para curto prazo. (AU)

Diversidade genética estimada com marcadores entre sequências simples repetidas em cultivos comerciais de Cupuaçuzeiro / Genetic diversity estimated using inter-simple sequence repeat markers in commercial crops of cupuassu tree

RESUMO:Quinze primers ISSR (entre sequências simples repetidas) foram utilizados para avaliar a diversidade genética entre e dentro de pomares comerciais de Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum. Para isso, foram analisados sessenta indivíduos, distribuídos nos três cultivos. Um total de 102 bandas foi amplificado, com uma porcentagem de 52,0% de polimorfismo em nível de espécie e média de 6,8 alelos por primer ISSR. A média do Índice de Conteúdo Polimórfico (PIC) foi de 0,55. Em relação aos índices de diversidade gênica de Nei (H) e de Shannon (I), os cultivos analisados apresentaram os valores: SAR H = 0,114 e I = 0,177; SSL H = 0,108 e I = 0,162 e SEC H = 0,104 e I = 0,156, considerados valores de moderados a baixos. A AMOVA revelou 34,91% da variância total entre os cultivos e 65,09% dentro deles. Os marcadores moleculares ISSR revelaram que há diversidade genética dentro de cada cultivo comercial estudado, portanto é possível selecionar genótipos superiores que poderão ser utilizados para originar cultivos mais uniformes. Esse resultado tem sido considerado de grande relevância, por fornecer ferramentas para a implementação de programas de melhoramento e delineamento de estratégias de conservação ex situ e in situ.

ABSTRACT:Fifteen ISSR (inter-simple sequence repeat) primers were used to evaluate the genetic diversity among and within commercial crops of T. grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum. For this, 60 specimens were analyzed, distributed in three crops. A total of 102 bands were amplified, with a polymorphism percentage of 52.0% at species level and an average of 6.8 alleles per ISSR primer. The average for polymorphism information content (PIC) index was 0.55. In relation to the genetic diversity index of Nei (H), and Shannon (I), crops analyzed showed the following values: : SAR H = 0,114 e I = 0,177; SSL H = 0,108 e I = 0,162 e SEC H = 0,104 e I = 0,156, considered moderate to low values. AMOVA showed 34.91% of total variance among the crops, and 65.09% within them. The ISSR molecular markers revealed that there is genetic diversity within each commercial crops studied, thus is possible to select superior genotypes that can be used to give more uniform crops. This result has been considered of great relevance, to provide tools for breding implementation programs and design conservation strategies ex situ and in situ.

Molecular characterization of beta-tubulin from Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian soybean rust

β-tubulins are structural components of microtubules and the targets of benzimidazole fungicides used to control many diseases of agricultural importance. Intron polymorphisms in the intron-rich genes of these proteins have been used in phylogeographic investigations of phytopathogenic fungi. In this work, we sequenced 2764 nucleotides of the β-tubulin gene (Pp tubB) in samples of Phakopsora pachyrhizi collected from seven soybean fields in Brazil. Pp tubB contained an open reading frame of 1341 nucleotides, including nine exons and eight introns. Exon length varied from 14 to 880 nucleotides, whereas intron length varied from 76 to 102 nucleotides. The presence of only four polymorphic sites limited the usefulness of Pp tubB for phylogeographic studies in P. pachyrhizi. The gene structures of Pp tubB and orthologous β-tubulin genes of Melampsora lini and Uromyces viciae-fabae were highly conserved. The amino acid substitutions in β-tubulin proteins associated with the onset of benzimidazole resistance in model organisms, especially at His6, Glu198 and Phe200, were absent from the predicted sequence of the P. pachyrhizi β-tubulin protein.

Clonal diversity and conservation genetics of the medicinal plant Carapichea ipecacuanha (Rubiaceae)

The roots of the understorey shrub Carapichea ipecacuanha (ipecac) have medicinal properties, and the uprooting of wild plants has supplied most of the world demand for this species. Although under severe population decline, C. ipecacuanha lacks legal protection. In the wild, the aerial stems of ipecac clump together to form clusters with well-defined borders. Cluster size may range from several to hundreds of aerial stems. To investigate the extent of clonality among aerial stems in ipecac clusters, we sampled 50 wild clusters (a total of 291 aerial stems) and screened them with 89 inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. The 291 aerial stems were grouped into 42 putative clones. The clonal groups generally consisted of aerial stems from the same cluster, and there was little or no genetic differentiation among aerial stems at the cluster level. These findings suggest that strategies designed to conserve ipecac in situ should not rely upon census data, which are based on the number of aerial stems per cluster and the number of clusters per population, because such data greatly underestimate the species effective population size and genetic diversity. Our results also indicate that this species needs protection at a federal level.

Reproductive studies in ipecac (Psychotria ipecacuanha (Brot. ) stockes; Rubiaceae): pollen development and morphology

The aim of this work was to carry out the reproductive studies on Brazilian accessions of ipecac, Psychotria ipecacuanha. It presented heterostyly, with brevistylous and longistylous flowers. The pollen development was observed from the sections of the anthers embedded in resin. Anther development was normal as usually observed in dicotyledones, displaying four layers: outer epidermis, endothecium, middle layer and inner tapetum. The pollen was bicellular and filled with starch at the microspore stage. Pollen morphology was studied using SEM, which showed pollen polymorphism within and between the two floral morphs. Five types of pollen with reticulate or perforate exine were identified. The characteristics showed that the sexual process was as important as the vegetative propagation for the reproduction of this species.

Foram realizados estudos reprodutivos em acessos brasileiros de poaia, Psychotria ipecacuanha. Poaia apresenta heterostilia, com flores brevistilas e longistilas. O desenvolvimento do pólen foi estudado em cortes de anteras embebidas em resina. O desenvolvimento da antera seguiu o padrão normal para as dicotiledôneas, a qual apresentou quatro camadas: epiderme, endotécio, camada média, e tapete, a mais interna. O pólen apresentou-se bicelular e preenchido com amido no estágio de micrósporo. A morfologia do pólen foi estudada utilizando-se MEV. Foi observado polimorfismo polínico dentro e entre as duas formas florais. Foram identificados cinco tipos de grãos de pólen, com exina reticulada ou perfurada. Em seu hábitat natural, sabe-se que essa espécie apresenta propagação por multiplicação vegetativa, mas as características estudadas demonstraram que o mecanismo sexuado é tão importante para a reprodução dessa espécie quanto à propagação vegetativa.